本作主人公“杀手先生”（樱井孝宏 配音）是一名职业杀手，只要接到委托就什么都杀，甚至是自己的父母或者是小学生的暑假作业。他有个弟子，是父母双亡的小学生，因为崇拜杀手先生而拜其为师。登场人物还有要向杀手先生报杀父之仇的17岁巨乳美少女、与杀手先生有多次近距离接触的警长、一条名为“五郎”的警犬。本动画每集篇幅为3分钟，充满了大量令人捧腹的冷笑话，可以说是以杀手先生为中心的冷笑话集锦。杀手先生虽然长相帅气，为人冷酷，实际上是个冷面笑匠，与美少女、警长等角色的接触中，产生各种超乎意料的搞笑桥段。
佐仓绫音 小野贤章 石见舞菜香 水树奈奈 立木文彦 诹访部顺一 平田广明 泽城美雪 竹内良太 樱井孝宏 富田美忧 岩本莲加 大塚明夫 石川由依 户谷菊之介 若山诗音 石田彰 平野绫 青木遥
市道真央 樱井孝宏 福岛润 大塚芳忠 小林亲弘 千本木彩花 江口拓也 冈咲美保 丰口惠美 古川慎 柳田淳一 泊明日菜 山本兼平 日高里菜 手冢弘道
高山南 山口胜平 山崎和佳奈 小山力也 林原惠美 岩居由希子 高木涉 大谷育江 绪方贤一 富田耕生 松井菜樱子 榊原良子 宝龟克寿 野上尤加奈 矶部弘 咲野俊介 石冢运升 茶风林 泽田敏子 皆口裕子 大川透 陶山章央 楠大典 柴田秀胜 三户耕三 梅津秀行 松本大 鸟海胜美 武田晶子 仓田雅世 小田敏充 知英 荣仓奈奈
栗田贯一 小林清志 增山江威子 井上真树夫 纳谷悟朗 津嘉山正种 筱原惠美 内海贤二 速水奖 天田益男 绪方贤一 岩永哲哉 阪脩 峰惠研 秋元羊介 塚田正昭 大川透 中博史 长岛雄一 青山穰
大川透 三宅健太 岛崎信长 代永翼 雪野五月 津田健次郎 宫田幸季 托德·哈伯空 花江夏树 坂本千夏 竹内顺子 樱井孝宏 神谷浩史 山寺宏一 三石琴乃 佐藤利奈 伊藤静 野岛健儿 藤井雪代 林原惠美 石田彰 山口由里子 立木文彦 子安武人 长泽美树 麦人 竹中直人 高山南 山崎和佳奈 小山力也 日高法子 森川智之 池田秀一 梁田清之 松井菜樱子 飞田展男 松本和香子 齐藤贵美子 高桥广树 名塚佳织 稻田彻 长岛雄一 柴田秀胜 野泽雅子 楠大典 桧山修之 小西克幸 大塚芳忠 银河万丈 大塚明夫 渡边久美子
大川透 铃木达央 榎木淳弥 小野大辅 野岛健儿 中村悠一 高桥伸也 福岛润 长绳麻理亚 梶裕贵 小西克幸 野濑育二 小野贤章 鸟海浩辅 千本木彩花 滨野大辉 相马康一 手冢弘道 千叶翔也 山下大辉 阪口大助 天崎滉平 诹访部顺一 藤真秀 小松史法 齐藤次郎 石川英郎 木岛隆一 福西胜也 高坂笃志 井上雄贵 高野麻美 Namiko Morimoto
岛村侑 浅野真澄 山村响 泽城美雪 立花慎之介 东山奈央 古城门志帆 新谷真弓 甲斐田幸 榊原良子 真殿光昭 日野聪 井泽诗织 伊东美弥子 中务贵幸 松本保典 仪武祐子 松浦爱弓 大原沙耶香 兴津和幸 木下浩之 筱原惠美 佳村遥 水野理纱 桥本结 新名彩乃 安艺启子 阿部敦 矢作纱友里 田丸笃志 村田太志 泽田敏子 栗田舞 千菅春香 矢部雅史 植田佳奈 小林裕介 山崎巧 佐古真弓 阪脩 兴梠里美 坂本真绫 牧口真幸 藤田咲 雪野五月 清水香里
梶裕贵 石川由依 井上麻里奈 下野纮 小林优 三上枝织 藤田咲 细谷佳正 桥诘知久 谷山纪章 岛村侑 津田健次郎 朴璐美 小野大辅 神谷浩史 子安武人
金元寿子 佐藤利奈 茅原实里 梶裕贵 花泽香菜 悠木碧 户松遥 井口裕香 伊濑茉莉也 藤田咲 野水伊织 南条爱乃 伊藤加奈惠 桑谷夏子 后藤邑子 大龟明日香 寺本来可 桥本舞
田中圭 桧山修之 松坂桃李 绪方贤一 藤田咲 井上麻里奈 樱庭奈奈美 增谷康纪 福井裕佳梨 胜生真沙子
小野友树 东山奈央 钉宫理惠 泽城美雪 平田广明 田村由香里 藤原启治 田中理惠 加藤英美里
石川由依 子安武人 浪川大辅 远藤绫 内山昂辉 茅原实里 户松遥
桑岛法子
丰崎爱生 日笠阳子 佐藤聪美
末柄里惠
松本梨香 大谷育江 牧口真幸 梶裕贵 伊濑茉莉也 林原惠美 三木真一郎 犬山犬子 上田祐司 佐藤惠 生天目仁美 三宅健太 松本真理香 饭塚昭三 佐藤健辅 泽井美优 石冢运升 三田佳子 足立梨花 中川刚 中川礼二 中川翔子 山寺宏一 内田笃人
能年玲奈 奥野瑛太 菲鲁兹·蓝 竹村叔子
未知
石川界人 井上麻里奈 生天目仁美 木村良平
田中理惠 今井麻美 阿澄佳奈 佐藤利奈 堀江由衣 喜多村英梨 小仓唯 石原夏织
小野友树 东山奈央 日笠阳子 下野纮 木野日菜 伊藤加奈惠 逢坂良太
三木真一郎 岩田光央 石冢运升 川澄绫子 矢尾一树 西村知道 子安武人 关智一
演员：小野友树 东山奈央 钉宫理惠 泽城美雪 平田广明 田村由香里 藤原启治 田中理惠 加藤英美里
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演员：石川由依 子安武人 浪川大辅 远藤绫 内山昂辉 茅原实里 户松遥
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